苯甲含量二型保品中测定醇的液体健食三种方法

2、种方中苯线性与精密度考察

（1）标准曲线溶液制备

GC：精密量取对照品储备液0.5、法测1.0、定液的含2.0、体型4.0、保健5.0mL分别置于10mL量瓶中，食品用无水乙醇定容，甲醇得标准曲线溶液，种方中苯按色谱柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，法测5μm)，定液的含流动相为甲醇(A)-20mmo/L乙酸铵溶液(B)，体型梯度洗脱(0～8min，保健10%A；8.1～20min，食品30%A；20.1～30min，甲醇10%A)，种方中苯流速为1.0mL/min，进样量为10uL，柱温为35℃，检测波长为210nm。HPLC：精密量取对照品储备液0.04、0.4、1.0、1.5、2.0mL分别置于10mL量瓶中，用50%甲醇溶液定容，得标准曲线溶液。

GC-MS：精密量取对照品储备液1mL置10mL量瓶中，加无水乙醇制成浓度为100μg/mL的对照品使用液，再精密量取0、0.4、0.2、0.5、1.0、2.0mL分别置于10mL量瓶中，用无水乙醇定容，得标准曲线溶液，按色谱条件:色谱柱为J&WDB-624UI(60mx0.25mmx1.4μm)，升温程序为初始温度60℃，保持1min，以50℃/min升温至150℃，保持2min，再以10℃/min升温至250℃，保持26min；载气为氦气，初始流量1mL/min，保持20min，以2mL/min升至2mL/min，保持20min，进样口温度250℃，分流比10:1，进样量1μL。

（2）测定结果

分别以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得线性回归方程和相关系数，测定结果如表1所示。结果表明，三种方法的相关系数均达到＞0.999，且精密度RSD均＜2%，表明线性和精密度良好。

3、检出限和定量限

精密量取各对照品溶液，以信噪比S/N=3和S/N=10为依据分别制成检出限溶液和定量限溶液，GC、HPLC、GC-MS三种方法的检出限分别5mgkg、10mg/kg和2mg/kg；定量限分别为17mg/kg、33mg/kg和6.7mg/kg。可见，GC-MS的检出限最低，灵敏度相对较高，HPLC的检出限相对较高，灵敏度相对较低。

4、回收率考察

取已知含量的某口服液0.5g各9份，根据曲线范围，按低、中、高浓度分别精密加入各自的对照品储备液(GC加入1、3、5mL，HPLC加入1、2、3mL，GC-MS加入0.1、0.3、0.5mL)，每个浓度3份，按各自的溶液制备方法制备回收率溶液，三种方法的回收率测定结果如表2所示。结果表明，三种方法的回收率均在90%～100%之间，方法的准确性良好。

5、稳定性考察

取三种方法制备的标准曲线中点浓度溶液和回收率考察的样品溶液，在室温条件下，分别于0、0.5、1、2、4、8、16、24h时在各自的色谱条件下测定，计算各时间点苯甲醇峰面积的RSD%。GC为1.1%、1.3%，HPLC为0.8%、0.9%，GC-MS为1.4%、1.3%，均小于2%，表明三种方法在室温下具有良好的稳定性，能满足日常检验的需求。

6、样品前处理方法的考察

依据GB5009.28-201方法，取含蛋白质的样品1.0g，加入适量的苯甲醇标准物质，再加入92g/L亚铁氰化钾和183g/L乙酸锌溶液各0.5mL后，精密称取苯甲醇对照品25mg置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀释并定容，得对照品储备液。取样品混匀，精密称取1.0g置于25mL量瓶中，加适量50%甲醇溶液超声提取10min，冷却至室温后定容，0.22μm滤膜滤过，得样品溶液高效液相色谱法项下制备样品溶液并测定含量，并与未加入蛋白质沉淀剂的加标样品溶液测定结果进行比较。结果表明，蛋白质沉淀剂对苯甲醇的测定无影响。

依据GB5009.139-2014方法，取含苯甲醇的样品1.0g，置于25mL量瓶中，加适量50%甲醇溶液超声提取10min后定容至刻度，再加入0.5g轻质氧化镁混匀，0.22μm滤膜滤过后按色谱柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流动相为甲醇(A)-20mmo/L乙酸铵溶液(B)，梯度洗脱(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速为1.0mL/min，进样量为10uL，柱温为35℃，检测波长为210nm色谱条件测定含量，并与未加入氧化镁的样品测定结果进行比较。结果表明，轻质氧化镁对苯甲醇的测定无影响。

依据GB5009.140-2003方法，取含苯甲醇的样品1.0mL，置于中性氧化铝(100～200目)柱中，用50%甲醇溶液洗脱至25mL容量瓶中，0.22μm滤膜滤过后测定含量，并与未过中性氧化铝柱的样品测定结果进行比较。结果表明，中性氧化铝柱对苯甲醇的测定无影响。

7、样品的测定

收集市售的40批液体型保健食品，精密称取苯甲醇对照品50mg置于50mL量瓶中，加无水乙醇稀释并定容，得对照品储备液。取样品混匀，精密称取1.0g，置于10mL量瓶中，加无水乙醇溶解并超声提取10min，冷却至室温后定容，0.22μm滤膜滤过，得样品溶液。精密称取苯甲醇对照品25mg置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀释并定容，得对照品储备液。取样品混匀，精密称取1.0g置于25mL量瓶中，加适量50%甲醇溶液超声提取10min，冷却至室温后定容，0.22μm滤膜滤过，得样品溶液。对照品储备液同气相色谱法项下储备液。取样品混匀，精密称取1.0g，置于10mL量瓶中，加无水乙醇溶解并超声提取10min后定容，0.22μm滤膜滤过，精密量取续滤液0.1mL置于10mL量瓶中，加无水乙醇定容，得样品溶液。

在色谱柱:J&WDB-WAX(60mx0.25mmx0.25μm)，升温程序为初始温度150℃，10℃/min升到180℃，保持3min，20℃/min升到230℃，保持5min；载气为氮气，恒流速度1.0mL/min，分流比10:1，检测器温度250℃，进样口温度240℃，进样量1μL。色谱柱:AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流动相为甲醇(A)-20mmo/L乙酸铵溶液(B)，梯度洗脱(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速为1.0mL/min，进样量为10uL，柱温为35C，检测波长为210nm。色谱条件:色谱柱为J&WDB--624UI(60mx0.25mmx1.4μm)，升温程序为初始温度60℃，保持1min，以50℃/min升温至150℃，保持2min，再以10℃/min升温至250℃，保持26min；载气为氦气，初始流量1mL/min，保持20min，以2mL/min升至2mL/min，保持20min，进样口温度250℃，分流比10:1，进样量1μL条件下测定，根据苯甲醇标准曲线范围调整样品的稀释体积，结果表明，有7批样品检出含苯甲醇，三种方法的测定结果一致(见表3)，相对标准偏差均小于5%。

7、三种方法比较

GC是测定挥发性或半挥发性成分的首选方法，其灵敏度好，进样量小，检测效率较高，检测成本低，但是仅采用保留时间定性，当样品中有杂质干扰时，需要调整升温程序实现最佳分离效果。

HPLC是实验室最普及的检测手段，在测定苯甲醇含量时，可以根据光谱图进行定性判定，但由于苯甲醇的最大吸收波长在210nm附近，属末端吸收，没有明显的吸收特征，当有杂质干扰时，可能会影响判定的准确性。但从本文的测定结果看，本方法与测定波长相近的10-羟基癸烯酸等功效性指标的分离度很高，受杂质干扰较少。

GC-MS相比前两种方法，其灵敏度最高，根据质谱图定性判定，并可准确定量，但仪器使用和维护成本较高，推荐作为GC和HPLC的辅助判定方法。

三、结论

本文建立的三种苯甲醇测定方法操作简单，准确性高，稳定性好，实验室可根据条件选择适宜的检验方法。三种方法相比，推荐使用HPLC法进行测定，GC-MS法辅助判定，也可直接采用GC-MS法，提高监测效率。

《保健食品备案产品可用辅料及其使用规定(2019年版)》中规定的苯甲酸及其钠盐在液体制剂中的最大使用量为1g/kg；在GB/T2731-2017《日用香精》1161中规定，苄醇(即苯甲醇)在第1类加香产品(唇用产品、玩具)中，最高限量为0.2%(即2g/kg)；根据JECFA提出的苄基化合物的总使用限值要求0～5mgkg体重(以苯甲酸当量计)，以成年人体重60kg计算，苯甲酸类ADI为0～300mg/d这几个标准均可作为制定食品或保健食品中苯甲醇限量的参考依据。

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